咨询热线

18766659171

当前位置:首页  >  资料下载  >  超微量分光光度计比色法分析于蛋白质研究应用

超微量分光光度计比色法分析于蛋白质研究应用
发布时间:2022/5/11      点击次数:169
   蛋白质通常是多种蛋白质的化合物,通过超微量分光光度计的比色法测定基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸、丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。
  比色法一般有bca,bradford,lowry几种:
  ★lowry法
  以早期的biuret反应为基础,并有所改进。蛋白质与cu2反应,产生蓝色的反应物。但是与biuret相比,lowry法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂;反应需要的时间较长;容易受到非蛋白物质的影响;含edta,tritonx-100,ammoniasulfate等物质的蛋白不适合此种方法。
  ★bca法
  一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与cu2反应产生cu,后者与bca形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系强,反应后形成的化合物非常稳定。相对于lowry法,操作简单,敏感度高。但与lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
  ★bradford法
  这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应,产生的有色化合物吸收峰595nm。其特点是敏感度好,是lowry和bca两种测试方法的2倍;操作更简单,速度更快;只需要一种反应试剂;化合物可以稳定1小时,方便结果;而且与一系列干扰lowry,bca反应的还原剂(如dtt,巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的。主要缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。
  以上几种方法到底该相信哪种?
  由于各种方法反应的基团以及显色基团不一,所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。即使测定同一样品,同一种比色法选择的标准样品不一致,测试后的浓度也不一致。因此在选择比色法之前,是参照要测试的样本的化学构成,寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外,比色法定量蛋白质,经常出现的问题是样品的吸光值太低,导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是,反应后超微量分光光度计的重要配件-比色杯的颜色有一定的半衰期,所以每种比色法都列出了反应测试时间,所有的样品(包括标准样品),都必须在此时间内测试。时间过长,得到的吸光值变小,换算的浓度值降低。除此,反应温度、溶液ph值等都是影响实验的重要原因。此外,非常重要的是,用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯,因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色,导致样品吸光值不准确。
  实验室确定细菌生长密度和生长期,多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验,需要采用超微量分光光度计准确测定细菌细胞密度。od600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液,之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作,必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数,做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的od值出现负值,原因是采用了显色的培养基,即细菌培养一段时间后,与培养基反应,发生变色反应。另外,需注意的是,测试的样品不能离心,保持细菌悬浮状态。
文件下载    
联系方式

邮箱:yuweichun@hzhaipei.cn

地址:浙江省杭州市拱墅区康中路10号3幢楼5楼

咨询热线

0571-86671317

(周一至周日9:00- 19:00)

在线咨询
  • 微信公众号

  • 添加微信

Copyright©2022 杭州海沛仪器有限公司 All Right Reserved    备案号:浙ICP备2021001787号-3    sitemap.xml
技术支持:化工仪器网    管理登陆